Rekombinantné genetické inžinierstvo

Izolovanie klonu

Všeobecne sa klonovanie uskutočňuje, aby sa získal klon jedného konkrétneho požadovaného génu alebo sekvencie DNA. Ďalším krokom po klonovaní je preto nájsť a izolovať tento klon medzi ostatnými členmi knižnice. Pokiaľ knižnica zahŕňa celý genóm organizmu, potom niekde v tejto knižnici bude požadovaný klon. Existuje niekoľko spôsobov, ako ju nájsť, v závislosti od konkrétneho príslušného génu. Ako sonda sa najčastejšie používa klonovaný segment DNA, ktorý vykazuje homológiu s hľadaným génom. Napríklad, ak už bol myšací gén klonovaný, potom sa tento klon môže použiť na nájdenie ekvivalentného ľudského klonu z ľudskej genomickej knižnice. Bakteriálne kolónie tvoriace knižnicu sa pestujú v zbierke Petriho misiek. Potom sa na povrch každej platne položí porézna membrána a bunky k nej prilnú. Bunky sa pretrhnú a DNA sa rozdelí na jednotlivé vlákna - všetko na membráne. Sonda je tiež rozdelená na jednotlivé vlákna a značená, často rádioaktívnym fosforom. Roztok rádioaktívnej sondy sa potom použije na kúpanie membrány. Jednovláknová sonda DNA bude priľnúť iba k DNA klonu, ktorý obsahuje ekvivalentný gén. Membrána sa vysuší a umiestni na vrstvu filmu citlivého na žiarenie a niekde na filmoch sa objaví čierna škvrna oznamujúca prítomnosť a umiestnenie požadovaného klonu. Klon je potom možné získať z pôvodných Petriho misiek.

genetika: technológia rekombinantnej DNA a polymerázová reťazová reakcia

Technické pokroky zohrávali dôležitú úlohu pri napredovaní genetického porozumenia. V roku 1970 americkí mikrobiológovia Daniel Nathans,

DNA sekvenovanie

Po klonovaní segmentu DNA je možné určiť jeho nukleotidovú sekvenciu. Nukleotidová sekvencia je najzákladnejšou úrovňou znalostí génu alebo genómu. Je to plán, ktorý obsahuje pokyny na vybudovanie organizmu a bez získania týchto informácií by nebolo možné pochopiť genetické funkcie alebo vývoj.

použitie

Znalosť postupnosti segmentu DNA má mnoho použití a nasleduje niekoľko príkladov. Po prvé, môže sa použiť na nájdenie génov, segmentov DNA, ktoré kódujú špecifický proteín alebo fenotyp. Ak bola oblasť DNA sekvenovaná, je možné ju skontrolovať na charakteristické znaky génov. Napríklad otvorené čítacie rámce (ORF) - dlhé sekvencie, ktoré začínajú štartovacím kodónom (tri susedné nukleotidy; sekvencia kodónu diktuje produkciu aminokyselín) a sú neprerušené stop kodónmi (s výnimkou jedného pri ich ukončení) - vyhľadajte oblasť kódujúca proteín. Ľudské gény tiež vo všeobecnosti susedia s takzvanými ostrovmi CpG - zhluky cytozínu a guanínu, dvoch nukleotidov, ktoré tvoria DNA. Pokiaľ je známe, že gén so známym fenotypom (ako je gén choroby u ľudí) je v sekvencii chromozomálnej oblasti, potom sa nepriradené gény v tejto oblasti stanú kandidátmi na túto funkciu. Po druhé, homológne sekvencie DNA rôznych organizmov sa môžu porovnávať, aby sa vyniesli vývojové vzťahy vnútri aj medzi druhmi. Po tretie, génová sekvencia môže byť testovaná na funkčné oblasti. Za účelom určenia funkcie génu je možné identifikovať rôzne domény, ktoré sú spoločné pre proteíny s podobnou funkciou. Napríklad určité aminokyselinové sekvencie v géne sa vždy nachádzajú v proteínoch, ktoré preklenujú bunkovú membránu; také aminokyselinové úseky sa nazývajú transmembránové domény. Ak sa transmembránová doména nachádza v géne s neznámou funkciou, naznačuje to, že kódovaný proteín sa nachádza v bunkovej membráne. Ostatné domény charakterizujú proteíny viažuce DNA. K dispozícii je niekoľko verejných databáz sekvencií DNA, ktoré môžu analyzovať ktorékoľvek zainteresované osoby.